- 李秀玲;鲁卫卫;张中洋;郝春生;郭会杰;张云涛;沈心亮;
目的研制安全有效的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)灭活疫苗,预防EV-A71感染所致疾病。方法通过比较不同临床EV-A71分离毒株免疫家兔后的免疫原性和细胞传代适应性,筛选EV-A71灭活疫苗生产毒株;建立多步层析纯化工艺,获得高纯度、高比活EV-A71抗原;采用随机双盲、多中心、试验疫苗与安慰剂对照优效性设计方案,在6～35月龄健康婴幼儿中接种2剂、3个批次EV-A71疫苗,观察对照组和疫苗组EV-A71及其他肠道病毒感染所致疾病发生病例数,计算疫苗保护效果。分析疫苗免疫原性、批间一致性和交叉免疫原性。结果依据中和抗体水平将087株确定为疫苗生产株。经超滤浓缩、柱层析纯化后,疫苗抗原目的蛋白纯度达95%以上、比活达800U/μg以上。第一年内疫苗对EV-A71所致住院/重症病例保护率为100.00%、对EV-A71所致手足口病保护率为90.93%、对EV-A71感染所致疾病保护率为81.85%;两年内对EV-A71感染所致手足口样疾病、手足口病的保护率达到95.00%,对EV-A71感染所致疱疹性咽峡炎、疱疹性口腔炎保护率达100.00%,对EV-A71感染所致住院/重症病例保护率达100.00%;但对CV-A16及除EV-A71、CV-A16外其他肠道病毒所致疾病未显现出明显的交叉保护作用。免疫前中和抗体阴性人群,EV-A71疫苗免疫后第56天,EV-A71中和抗体阳转率达到91.7%以上,中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)达到325.3。3批次试验疫苗接种人群间首针免疫后第56天GMT比值的95%可信区间均在等效区间0.67～1.5内,提示3个批次试验疫苗具有较好的一致性。结论 EV-A71疫苗对EV-A71感染所致疾病具有较好的保护效果。
2018年06期 v.8 445-450页 [查看摘要][在线阅读][下载 1159K] - 顾美荣;高帆;张改梅;肖霞;李国顺;陈磊;郭林;肖海峰;刘建凯;毛群颖;郑海发;
目的评价重组肠道病毒71型(EV-A71)疫苗的免疫原性和保护效果。方法将重组EV-A71疫苗按0、14d程序免疫BALB/c小鼠,采用微量细胞病变法测定一针免疫、二针免疫14d后的EV-A71中和抗体效价,应用酶联免疫吸附法测定二针免疫14d后小鼠脾单个核细胞分泌的细胞因子水平。乳鼠颅内攻击EV-A71病毒,同时将疫苗免疫后小鼠血清通过腹腔注射乳鼠,计算乳鼠生存率及半数动物保护性抗体水平。结果重组EV-A71疫苗一针免疫小鼠后诱导产生的EV-A71中和抗体阳转率即达100%,二针免疫小鼠后诱导产生的EV-A71中和抗体效价显著高于一针免疫(P=0.000),疫苗可诱导小鼠产生Th1和Th2类细胞因子应答。乳鼠颅内攻击20μl原倍EV-A71/M6病毒,同时将疫苗免疫小鼠血清160、40、10、2.5、0.625和0.156 25U分别经腹腔注射乳鼠,连续观察22d,乳鼠生存率分别为100%、100%、70%、20%、0和0,对照组乳鼠于第8天全部死亡,采用Reed-Muench法计算平均半数动物保护中和抗体效价(ED50)为5.59U。结论重组EV-A71疫苗可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,并可保护乳鼠免受EV-A71病毒感染。
2018年06期 v.8 451-455页 [查看摘要][在线阅读][下载 1119K] - 高帆;卞莲莲;吴星;董少忠;李静;徐葛林;毛群颖;梁争论;
目的 EV-A71疫苗是近年来新上市应用于婴幼儿的预防性疫苗,上市后质量的一致性对保证该疫苗安全、有效具有重要意义。方法对3家企业2017年生产的EV-A71疫苗的关键控制指标(体外效力和体内效力)进行趋势分析,并与2016年趋势分析结果进行比较;将中国食品药品检定研究院(National Institutes for Food and Drug Control,NIFDC)检测结果与企业结果进行比较。结果 2017年度三家企业的体外效力趋势分析结果显示未见超趋势(out of trend,OOT)。体内效力趋势分析发现企业2有2次连续8批以上结果位于平均值一侧,企业3有2次超出行动限。经偏差调查发现生产、质控环节均未发现异常情况,判定为动物个体差异造成OOT,对EV-A71疫苗质量无影响。2016年度和2017年度比较结果显示两家企业年度间具有较好的一致性。NIFDC与3家企业体外效力检测结果比较差异均无统计学意义(P=0.580 5,P=0.150 8,P=0.115 1);Bland-Altman法统计显示,98.1%批次的检测结果在不同浓度范围内的差值位于2倍标准差(2s)以内。结论上市的EV-A71疫苗质量稳定、可控。今后应加强趋势分析中对OOT结果的调查、反馈,加强年度间比较分析,以及NIFDC与企业质控实验室间的比对研究。
2018年06期 v.8 456-462页 [查看摘要][在线阅读][下载 2082K] - 毛群颖;高帆;胡亚林;崔博沛;卞莲莲;杜瑞晓;梁争论;
目的评价我国三家企业生产的肠道病毒71型(EV-A71)灭活疫苗的小鼠中和抗体应答水平和攻毒保护能力,为了解新上市EV-A71疫苗的免疫保护特性提供基础。方法应用小鼠模型,分别对上市的3家企业EV-A71灭活疫苗(编盲为A、B、C疫苗)进行中和抗体应答水平、被动免疫和主动免疫攻毒保护研究。结果一剂人用剂量A、B和C疫苗免疫后,EV-A71中和抗体几何均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为331、132和69U/ml,A疫苗显著高于B疫苗和C疫苗(P<0.05)。应用3家疫苗免疫血清被动保护,结果显示半数有效剂量(ED50)分别为1.9、50.4和8.2U/ml,提示3家疫苗免疫抗体均具有良好的保护能力,但随抗体稀释倍数的增加保护率下降趋势不同。EV-A71疫苗免疫主动保护结果显示,4倍稀释的3家EV-A71疫苗一针免疫即可获得100%的保护效果,但同样随剂量降低,保护率下降趋势不同,一针和二针免疫保护的ED50值分别为人用疫苗剂量的203.2、24.4和41.5倍,及396.4、121.4和127.5倍。结论我国不同厂家EV-A71灭活疫苗一针免疫即可获得良好的免疫应答和保护能力,抗体应答和保护水平与临床前研究一致,但三家疫苗特性存在一定差异,应进一步深入开展相关基础研究,充分保证上市后EV-A71疫苗的有效性。
2018年06期 v.8 463-468页 [查看摘要][在线阅读][下载 1676K] - 毛群颖;高帆;卞莲莲;崔博沛;杜瑞晓;徐苗;梁争论;
目的在率先创建了我国肠道病毒71型(EV-A71)中和抗体(NTAb)国家标准品(NS),之后建立国际标准品(IS)的背景下,对我国NS进行国际单位(IU)赋值。方法通过包括全球7个国家和地区,18个实验室(Lab)参加的国际协作标定研究,对NS和IS同时进行协作标定,并分别采用疫苗免疫婴幼儿血清和自然感染成人血清进行适用性研究,评价NS对实验室间和毒株间检测的影响,并对其进行国际单位赋值。结果共17个Lab应用统一的C4毒株完成了全部协作标定。其中,Lab14和Lab17还同时采用B4毒株完成全部标定。各实验室间检测结果具有相同趋势,NS (1 000U/ml)和IS (1 000IU/0.5ml)的NTAb几何平均滴度(GMT)分别为621和640。分别以NS和IS标化,当均应用C4毒株时,各实验室间检测变异系数(GCV)分别从原始效价的71%降至40%和38%;当采用不同毒株(C4、B4型)时,Lab14的检测差异从原始效价的2.11倍降至1.36、1.84倍;而Lab17的检测差异从2.49倍降至0.82、1.39倍。结论 EV-A71NTAb NS中和活性良好,定量准确,能有效降低实验室间和毒株间检测误差,以IS标定应赋值1 940IU/ml,用于EV-A71NTAb检测方法的质量控制和标化。
2018年06期 v.8 469-475页 [查看摘要][在线阅读][下载 1751K] - 张改梅;陈磊;高帆;姚昕;李国顺;顾美荣;毛群颖;刘建凯;郑海发;
目的建立重组肠道病毒71型疫苗(EV-A71)(汉逊酵母)抗原含量测定方法,用于重组EV-A71(汉逊酵母)疫苗的质量控制。方法以抗EV-A71 (汉逊酵母)多克隆抗体为包被抗体,经辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的抗EV-A71单克隆抗体为检测抗体,建立双抗体夹心酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),确定定量限度及最佳定量范围,并对该方法的准确度、精密度和特异性进行方法学验证。结果线性范围为5～80 U/ml,线性和平行性良好。定量下限为5U/ml,检测不同浓度的EV-A71国家抗原标准品,回收率在88%～115%,准确度良好;重复性和中间精密度测定,其变异系数均小于15%;与重组柯萨奇病毒A16、甲型肝炎灭活疫苗(HAV)、冻干水痘减毒活疫苗(VZV)、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)、五价口服轮状病毒减毒活疫苗(RV)等疫苗、Tris缓冲液、PBS缓冲液、破碎液、汉逊酵母宿主蛋白(HCP)均无交叉反应,其专属性良好。结论建立了重组EV-A71疫苗(汉逊酵母)抗原含量测定方法并进行了初步验证,为疫苗研制中抗原含量的质控提供了可靠的检测手段。
2018年06期 v.8 476-480页 [查看摘要][在线阅读][下载 1157K] - 毛群颖;高帆;王泽鋆;李秀玲;高强;安文琪;杨二霞;卞莲莲;杜瑞晓;崔博沛;徐苗;梁争论;
目的建立第一代国家柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)抗原标准品,用于CV-A16疫苗的抗原含量检测。方法由中国食品药品检定研究院(中检院)牵头,联合我国主要的CV-A16灭活疫苗研发单位,共计6个实验室,采用协标试剂盒,分别对两个相同、编盲设置的候选CV-A16抗原标准品(A、B)进行CV-A16抗原含量协作标定。并且分别采用各实验室建立的CV-A16抗原检测试剂盒和各自工艺制备的CV-A16疫苗原液,以候选标准品为标准进行适用性研究。结果各实验室A/B相对抗原含量比为0.978～1.082 (CV:6.2%～12.4%),表明各实验室检测结果准确、可靠。故将A、B结果合并分析。候选标准品(A、B)的几何均值为2 194.5kU/ml,几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)为11.0%,且协标结果呈正态分布,符合标准品研制要求。将候选标准品的抗原含量暂定为2 000U/ml进行适用性研究,共3家实验室完成该研究,结果显示3个采用各自工艺制备的CV-A16原液,在各自建立的CV-A16检测试剂盒上均与候选标准品具有良好的线性和平行性,适用性良好。结论建立的候选标准品可作为CV-A16抗原标准品,赋值为2 000U/ml,用于CV-A16疫苗的抗原含量检测。
2018年06期 v.8 481-486页 [查看摘要][在线阅读][下载 1404K] - 卢佳;张林林;安泰学;毛群颖;李鹏飞;张夫坤;王泽鋆;李黎;周辉;王继麟;陈晓琦;梁争论;申硕;
目的研究柯萨奇病毒A16型(CV-A16)疫苗候选株不同形态病毒颗粒与不同佐剂配伍后在小鼠模型中的免疫原性和保护性。方法将不同佐剂与不同剂量的CV-A16疫苗候选株纯化抗原配制成疫苗,免疫小鼠后检测小鼠血清内抗CV-A16的总抗体水平以及中和抗体水平,并评价母传抗体对新生乳鼠的保护作用。结果 CV-A16疫苗候选株可在小鼠体内诱导高水平的体液免疫应答,免疫后的小鼠血清中和抗体水平可达8 192,并可交叉中和CV-A16病毒原型株(A型)以及异源亚基因型(B2b)。疫苗免疫母鼠生产的乳鼠在被10 000LD50的同源或异源CV-A16病毒攻击后,可免于发病和死亡。结论 CV-A16疫苗候选株具有良好的免疫原性和保护性,可作为CV-A16灭活疫苗或多价手足口病灭活疫苗的候选毒株。
2018年06期 v.8 487-494页 [查看摘要][在线阅读][下载 1782K] - 毛群颖;胡亚林;孙一晟;高帆;邹强;卞莲莲;范昌发;梁争论;
目的筛选可用于CV-A16疫苗免疫原性评价的最适实验动物及中和抗体检测毒株,为构建CVA16疫苗免疫原性评价方法提供依据。方法采用CV-A16灭活疫苗免疫6种实验室常用动物BALB/c、ICR、NIH、KM鼠、豚鼠、SD大鼠以及对肠道病毒敏感的SCARB2-转基因小鼠和沙鼠,于一针和两针免疫后采血,分别用B基因型ZJ31/02、ZJ90/02、ZJ20/01毒株和A基因型原型株(G10)作为检测毒株进行CV-A16中和抗体应答水平研究。结果一针免疫后,全部组别的中和抗体应答水平均较低,ZJ31/02、ZJ90/02、ZJ20/01和G10检测的NTAb阳转率均值分别为51.3%(0～80%)、40.0%(0～70%)、12.5%(0～20%)和5.0%(0～20%);二针免疫后,抗体水平出现明显升高,阳转率均值分别为95.0%(80%～100%)、88.8%(70%～100%)、58.8%(0～100%)和65.0%(0～90%);GMTs均值分别为55.5、46.4、20.2和11.7。以ZJ31/02和ZJ90/02的检测结果最高,阳转率显著高于ZJ20/01 (P<0.05)。采用该两检测株检测时,KM鼠和SD大鼠的抗体应答最强,阳转率均可达90%,GMTs均高于100。结论CV-A16灭活疫苗二针免疫KM小鼠和SD大鼠可诱导较好的特异性中和抗体应答,可将ZJ31/02和ZJ90/02作为检测毒株,结合标准物质建立标准化CV-A16疫苗体内效力和免疫原性评价方法。
2018年06期 v.8 495-500页 [查看摘要][在线阅读][下载 1153K] - 高帆;胡亚林;孙世洋;付莹;卞莲莲;苏瑶;吴星;朱凤才;毛群颖;梁争论;
目的了解引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要6种人类肠道病毒(enteroviru,EV)在我国婴幼儿人群中的流行情况,分析相同血清型EV重复感染以及不同血清型EV的感染特点,为HFMD多价疫苗的研发提供依据。方法采用前瞻性队列研究的方法,对江苏省某地EV-A71疫苗Ⅲ期临床试验的181名6～35月龄婴幼儿在2012-2014年进行为期2年的随访。随访期间对受试者采集4次血清,采用微量细胞病变法检测血清中的肠道病毒A组71型(EV-A71)、柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)、柯萨奇病毒B组3型(CVB3)和柯萨奇病毒B组5型(CV-B5)中和抗体效价。对随访期间的HFMD发病病例采集咽拭子和肛拭子,采用实时定量PCR法和巢式PCR法鉴别EV。结果在随访结束时,CV-A10的血清累积阳性率和中和抗体GMT最高(82.2%,120.4)。随访期间共有81人发生125次相同血清型EV的重复感染(中和抗体阳性者的中和抗体4倍及以上增高),其中CV-A10的重复感染率最高(27.8%,50/180)。虽然相同血清型EV可重复感染,但未见同种病原感染后的再次发病;68.5%(124/181)的受试者至少感染了两种EV,2.2%(4/181)的受试者感染了5种EV。共发现25例HFMD发病病例(7例EV-A71,14例CVA16,CV-A6、CV-A10、CV-B3和CV-B5各1例),患者均为轻症,未见重症病例。结论该地区婴幼儿人群中EV流行强度高,EV具有一定的相同血清型及不同血清型的重复感染率,值得进一步研究。
2018年06期 v.8 501-508页 [查看摘要][在线阅读][下载 1812K] - 卞莲莲;毛群颖;高帆;吴星;孙世洋;杨晓明;梁争论;
目的分析我国大陆地区柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)流行株基因结构及引起重症手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)毒株的序列特征。方法从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库下载我国大陆地区各省份或地区不同年份的流行株序列信息,使用MEGA 5.2软件构建系统进化树,应用Simplot软件进行重组分析,应用MegAlign软件对引起厦门2015年重症手足口病暴发的毒株进行比对分析。结果我国大陆地区在2010年之前曾有Lineage C毒株流行,2010年之后流行的毒株均属于Lineage E,且表现为E2和E3毒株共同流行的趋势。未见已报道的CV-A10大陆流行株与其他血清型人类肠道病毒发生重组。引起不同症状的毒株在序列同源性上未见显著差异,而引起厦门2015年重症HFMD暴发的毒株在5′-UTR区128～130位点处存在3个核苷酸位点(ACT)缺失。结论应加强CV-A10的监测和流行病学研究,为CV-A10疫苗及多价HFMD疫苗的研发奠定基础。
2018年06期 v.8 509-514页 [查看摘要][在线阅读][下载 2171K] - 吴星;苏瑶;董方玉;陈盼;李克雷;高帆;卞莲莲;孙世洋;胡亚林;毛群颖;梁争论;
目的以含报告基因的柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)假病毒(pCV-A6-Luc),建立CV-A6可视化感染模型,用于疫苗的有效性评价。方法比较BALB/c、C57BL/6、ICR、NIH、KM小鼠对pCV-A6-Luc的敏感性,确定模型动物;进行小鼠周龄选择、检测时间摸索以及假病毒感染剂量优化等研究,确定模型体系;通过给小鼠接种灭活CV-A6病毒或被动免疫抗血清观察保护效果。结果通过不同品系小鼠对假病毒的敏感性比对,确定将BALB/c小鼠作为模型动物,并确定了使用4周龄小鼠作为假病毒攻毒时间,攻毒后16h为检测时间。半数动物感染剂量(AID50)研究结果表明,活体成像发光值与pCV-A6-Luc攻毒剂量呈现良好的剂量效应关系(r2=0.996),Reed-Muench法计算pCV-A6-Luc感染BALB/c小鼠的AID50攻毒剂量为2.86×108拷贝。主动免疫和被动免疫研究结果表明,抗体及灭活疫苗均可抑制pCV-A6-Luc对小鼠的感染。主动免疫实验组小鼠活体成像发光强度和中和抗体检测结果均明显低于对照组。结论本研究建立了安全、敏感、可视化的CV-A6报告基因假病毒可视化感染模型,该模型可应用于CV-A6疫苗评价及药物筛选研究。
2018年06期 v.8 515-520页 [查看摘要][在线阅读][下载 1820K]