- 梁燕;赵红玲;刘龙丁;廖芸;董承红;纳锐雄;张莹;王晶晶;王丽春;李琦涵;
目的规模化制备3批肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞),研究其免疫原性。方法在人二倍体细胞上适应的EV71毒株经灭活、纯化后,制备成为EV71灭活疫苗成品。采用0、4周2针程序,皮下注射免疫恒河猴,于第2次免疫后2、4～72周取外周静脉血分离血清进行中和抗体测定,同时于第2次免疫后8周时取外周静脉血采用γ干扰素酶联免疫斑点(IFN-γELIspot)方法检测细胞免疫应答。通过EV71毒株颅内注射乳鼠的研究方法,获得乳鼠攻毒的半数致死量(LD50),按5倍LD50对疫苗免疫母鼠所生的乳鼠攻毒,评价疫苗的动物保护效果。结果 EV71灭活疫苗免疫恒河猴后,2针免疫后2周即可诱导中和抗体的产生,其抗体水平可达到1∶32,在2针免疫后72周时中和抗体水平仍能维持在1∶16～1∶32;于2针免疫后第8周取血,疫苗组诱导产生IFN-γ斑点数[250斑点形成细胞(SFC)/1×106外周血单核细胞(PBMCs)]显著高于接种生理盐水的对照组(16SFC/1×106 PBMCs),P<0.01。EV71疫苗对小鼠—乳鼠免疫的保护性研究结果表明,接种EV71疫苗后,在5倍LD50攻毒情况下,对乳鼠的保护率达到100%。结论规模化生产制备以人二倍体细胞作为细胞基质的EV71疫苗,具有较好的免疫原性。
2012年06期 v.2 9-14页 [查看摘要][在线阅读][下载 341K] - 李秀玲;张中洋;王潇潇;郝春生;杨永娟;李懿;马淑花;刘宇;郭会杰;吴蕴怡;张晨;张冲;陈明;赵敏;宁海京;田龙;刘松友;沈心亮;
目的评价研制的肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗的免疫原性和保护性效果。方法 EV71FY7VP5/AH/CHN/2008株感染Vero细胞后,收获病毒培养液,经灭活、浓缩和纯化后制备EV71灭活疫苗,并通过高效液相色谱法(HPLC)进行纯度分析、Western blot进行特异性鉴定。采用不同剂量疫苗免疫食蟹猴,间隔1周采集血清,连续采集9周,采用微量细胞病变抑制法对血清中和抗体进行检测。疫苗免疫动物血清通过腹腔注射至乳鼠后,对乳鼠进行病毒攻击,计算乳鼠生存率及半数动物保护性抗体水平。结果 HPLC分析结果提示,制备的纯化EV71灭活疫苗纯度可达96.6%;Western blot检测结果显示,其可与EV71特异性多抗结合。不同剂量的EV71灭活疫苗免疫食蟹猴,可诱导产生较高水平的EV71特异性中和抗体,中和抗体水平于第2剂接种后1周达到高峰,随后中和抗体维持在一定的水平,中和抗体水平与疫苗剂量存在明显的量效关系;采集小鼠免疫血清,测定中和抗体效价为1∶512,将其进行4、16、64、256倍系列稀释,经腹腔注射乳鼠后,进行病毒攻击,连续观察14d,乳鼠生存率分别为100.0%、100.0%、50.0%、28.6%;对照组乳鼠于病毒攻击后5～7d全部死亡。采用寇氏法计算,平均半数动物保护中和抗体效价为1∶11。结论制备的EV71灭活疫苗可诱导产生高水平的中和抗体,并可保护乳鼠免受EV71感染。
2012年06期 v.2 15-18页 [查看摘要][在线阅读][下载 219K] - 刘静;陈路佳;郭基涛;张浩;朱萌;高萌;徐萍;彭宜红;
目的利用课题组前期分离获得的EV71临床分离毒株,对其全基因组序列测定及分析,建立EV71感染的动物模型,分析其基因序列与致病性的关系。方法利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)分段扩增EV71全长基因,对各扩增片段进行克隆和测序;用软件MEGA 5、RNAstructure 5.3进行基因组结构及特点分析;腹腔注射毒株建立EV71感染的ICR乳鼠模型。结果得到3个部分相互重叠并涵盖全基因组的重组质粒,测序后拼接成全基因序列,命名为EV71 BC08株存入GenBank(JQ514785)。序列分析表明BC08株为EV71C4a基因亚型,其5′非编码区(5′UTR)A627点突变可能影响病毒5′UTR二级结构。BC08株能感染乳鼠并导致其出现神经系统症状,病理学研究表明受染乳鼠肌肉和大脑组织有病毒VP1蛋白表达。结论 BC08毒株基因组全长7 406bp,为C4a亚型,与近年我国EV71流行株有很高的同源性(>95%),但A627点突变可能影响病毒5′UTR二级结构及功能。BC08毒株可感染乳鼠并致病,这对该临床分离株的致病能力提供了直接证据,也为建立EV71感染的乳鼠模型奠定基础。
2012年06期 v.2 19-25页 [查看摘要][在线阅读][下载 494K] - 袁静;吴绪伟;郑红梅;曹向红;潘小霞;滕玉梅;李琦涵;陈元鼎;
目的构建轮状病毒(rotavirus,RV)VP6载体及携带乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)外源抗原表位的嵌合质粒,进一步探索研发携带HBV抗原表位的重组嵌合疫苗的技术。方法运用基因克隆和重组技术,构建轮状病毒VP6载体,同时将HBV编码中和抗原表位21个氨基酸的基因序列构建到VP6载体上相应酶切位点,在大肠杆菌中表达嵌合蛋白,并进行相关免疫学性质的研究。结果重组嵌合蛋白rVP6/Hs可在大肠杆菌系统中高效表达,表达的蛋白占菌体总蛋白的36.2%,纯度90%以上;ELISA结果显示,嵌合蛋白可与抗-HBs抗体反应;Western blot实验表明,嵌合蛋白可分别与抗VP6豚鼠血清抗体和乙型肝炎患者血清抗体特异性结合。结果表明所表达的嵌合蛋白具有较好的抗原反应性。结论成功构建载体质粒pETP6v及携带HBV外源抗原表位的嵌合质粒pETP6/Hs,对研究病毒抗原表位具有重要的价值;所构建和表达的携带HBV S抗原表位的重组嵌合蛋白在研发RV/HBV重组嵌合蛋白疫苗方面具有重要潜在应用前景。
2012年06期 v.2 26-31页 [查看摘要][在线阅读][下载 361K] - 张荣建;贺争鸣;
目的建立G亚属猴腺病毒(simian adenovirus,SAdV)特异的荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法根据G亚属SAdV基因保守区,设计特异性引物和TaqMan探针。制备重组质粒pGEM-TEasy-SAdVpol标准品,建立标准曲线。经灵敏度、特异性、准确性和重复性评价后,检测33份猴粪便样本和4批次脊髓灰质炎疫苗。结果建立的FQ-PCR检测方法特异检测G亚属,与A、F亚属无交叉反应,准确性及重复性较好。标准曲线相关系数0.999,线性范围6lg(60～6×106拷贝),最低检出限可达6拷贝/μl。33份猴粪便样本中15份为阳性(45.5%),4批脊髓灰质炎疫苗均为阴性。结论建立的FQ-PCR检测方法可定量检测G亚属SAdV拷贝数,初步应用表明我国实验猴群中G亚属SAdV流行率较高,应加强监测避免人类感染的潜在风险。
2012年06期 v.2 32-35页 [查看摘要][在线阅读][下载 349K] - 范俊婉;郭敬;于成接;张安定;金梅林;
目的分析H5N1流感病毒NS1蛋白D92E的变异趋势,为研究禽流感病毒的致病性及其逃避宿主免疫应答提供科学依据。方法利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的流感数据库,搜索2000年以前以及2000年以后世界各地流行的A/human/H5N1、A/avian/H5N1、A/swine/H5N1流感病毒的相关信息,然后进行NS1蛋白序列比对,分析其变异趋势。结果 2000年以前H5N1流感病毒NS1蛋白第92位大部分是谷氨酸,而2000年以后H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位大部分是天冬氨酸。结论 H5N1流感病毒的NS1蛋白第92位天冬氨酸的存在有可能增强了病毒的抵抗力和毒力。
2012年06期 v.2 36-39页 [查看摘要][在线阅读][下载 505K] - 李文静;李航;王福祥;李用国;
目的分析哈尔滨市39例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者原发耐药的情况,明确哈尔滨市HIV/AIDS患者原发耐药的耐药谱,为今后该市确定对于HIV/AIDS患者进行高效抗逆转录病毒治疗方案提供参考。方法应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对哈尔滨市39例未经抗病毒治疗的HIV-1感染者血浆HIVpol基因序列进行扩增,分析耐药突变位点以及对各类抗病毒药物的耐药程度。结果 39例扩增阳性的pol区基因中,系统进化树分析结果显示:B亚型共18例(46.15%),包括泰国B′7例(17.95%),欧美B 11例(28.21%);CRF01_AE亚型15例(38.46%);07_BC亚型5例(12.82%);1例出现CRF01_AE与A亚型的重组(2.56%)。基因型耐药结果分析显示:针对蛋白酶抑制剂,未出现蛋白酶抑制剂(PI)主要耐药突变,9例出现次要耐药突变(L10I、A71T/V)。针对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI),出现3例核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变(K219Q、T69N),导致对去羟肌苷(ddI)、齐多夫定(AZT)、司他夫定(d4T)的潜在低度耐药;出现10例非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变(V179D/E),导致对依非韦伦(EFV)、奈韦拉平(NVP)潜在低度耐药。结论哈尔滨市未经治疗的HIV-1感染者中原发耐药的发生率出现上涨趋势,需引起足够的重视。
2012年06期 v.2 40-45页 [查看摘要][在线阅读][下载 327K] - 王毅;李伟;孙玲;张科;樊静;许强;龙星;
目的了解绵阳市安县男男性行为人群(MSM)艾滋病病毒(HIV)感染相关防治知识、性行为特征及感染现状,以指导防治措施的制定。方法 2011年4～9月,采用滚雪球抽样方法,在知情同意下,在一固定茶园,结合社区干预活动,每月1次进行MSM的招募和现场自填式匿名行为学调查,并对调查对象采血进行HIV检测。结果共调查89人,平均年龄(23.4±5.5)岁,高中或中专文化63人(70.8%),未婚81人(91.0%)。HIV知识得分671分,总知晓率94.2%;近1周平均肛交(1.3±1.1)次,年龄较小者肛交次数较多(χ2=10.119,P=0.006)。近6月有男性肛交行为者76人(85.4%),每次使用安全套30人(39.0%),近1次男性肛交使用安全套54人(70.1%);近6月、近1次肛交安全套使用率均随年龄增加而下降(χ2值分别为4.263、8.259,P值分别为0.039、0.004)。近6月5人有异性性行为(5.6%),每次使用安全套1人(20.0%)。HIV确证阳性5人,感染率为5.6%。结论绵阳市安县MSM人群HIV知晓率较高,安全套使用率较低,知识与行为分离明显,HIV感染率较高,应加大干预力度。
2012年06期 v.2 46-49页 [查看摘要][在线阅读][下载 129K] - 类延花;胡中旺;王海;秦义组;李钰;姚晖;金琳;吴建军;
目的研究合肥市男男性行为人群(MSM)中未经抗病毒治疗的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的HIV-1基因亚型和耐药突变的发生流行情况。方法收集合肥市2011-2012年确认的35例HIV-l感染者外周静脉血,提取血浆中HIV基因组RNA,用逆转录PCR(RT-PCR)和巢式PCR方法扩增HIV-1 pol区核酸序列,基因序列测定、拼接后,上传至美国斯坦福大学HIV耐药数据库在线进行耐药性分析。结果获得的35个pol区有效序列中,CRF01_AE亚型比例最大,达57.1%(20例);其次为B亚型,达34.3%(12例)。没有针对蛋白酶抑制剂(PIs)的主要耐药性基因突变。发现针对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)的耐药突变2例,其中仅1例携带V179D原发耐药变异。对依非韦伦(efavii-rens,EFV)、奈韦拉平(nevirapine,NVP)、依曲韦林(etravirine,ETR)和利匹韦林(rilpivirin,RPV10)存在不同程度的耐药,RT区耐药株传播率为2.9%。结论在合肥市MSM人群中,未经治疗的新发HIV感染者已经出现针对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)的耐药突变株,应引起重视;原发耐药目前尚处于较低水平(<5%)。
2012年06期 v.2 50-54页 [查看摘要][在线阅读][下载 279K] - 肖珑;胡瑾华;段学章;刘晓燕;刘士敬;荣义辉;辛绍杰;
目的构建带有核定位信号(NLS)和线粒体定位信号(MLS)的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)真核表达载体,并检测其在人胚肾293FT细胞中的表达和亚细胞定位情况。方法采用PCR技术分别扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx序列,人工合成编码NLS和MLS的核酸序列,依次将其克隆至pcDNA4.0载体中。将重组质粒转染293FT细胞,Western blot检测融合蛋白的表达情况,荧光显微镜观察带有定位标签的HBx在细胞中的定位。结果测序鉴定结果表明带有NLS、MLS和EGFP标签的HBx真核表达载体构建成功,转染293FT细胞能够正常表达融合蛋白,在荧光显微镜下,NLS和MLS能够将EGFP-HBx融合蛋白分别定位于细胞核和线粒体。结论本研究构建的能够特异性靶向HBx蛋白至细胞核和线粒体的真核表达载体,能够在哺乳动物细胞293FT细胞中表达,为进一步深入研究不同定位HBx的生物学功能奠定了基础。
2012年06期 v.2 55-59页 [查看摘要][在线阅读][下载 233K]